۰ بازدید

آخرین به‌روزرسانی: ۰۸ بهمن ۱۴۰۲

زمان مطالعه: ۷ دقیقه

برای درمان بسیاری از بیماری‌ها ترکیبات شیمیایی یا بیولوژیکی جدید استفاده می‌شود. این ترکیبات با تغییر فعالیت آنزیم‌ها، تغییر ساختار سلول یا تغییر بیان ژن‌ها فعالیت سلول‌ها را تغییر می‌دهند و بیماری درمان می‌شود. اما ترکیبات جدید ممکن است با ساختارها و مولکول‌های حیاتی برای بقا و تکثیر سلول‌ها برهم‌کنش دهند و منجر به مرگ سلول‌ها شوند. به این ویژگی سمیت سلولی ماده شیمیایی گفته می‌شود. سمیت سلولی هر ماده شیمیایی و بیولوژیکی قبل از ورود به بدن انسان باید به کمک سلول‌های کشت داده شده در آزمایشگاه بررسی شود. تست mtt یکی از روش‌ها بررسی سمیت سلولی است. این تست بر اساس تغییر رنگ نمک mtt در اثر فعالیت متابولیکی سلول‌ها طراحی شده است.

آنزیم‌های دهیدروژناز سلول‌های زنده نمک mtt را کاهش می‌دهد. تغییر ساختار این نمک منجر به تغییر رنگ آن از زرد به بنفش می‌شود. هر چه شدت رنگ ایجاد شده بیشتر باشد، تعداد سلول‌های زنده بیشتر است. به کمک این تست می‌توان غلظتی از ماده که منجر به مرگ سلول می‌شود را محاسبه کرد. در این مطلب از مجله فرادرس مراحل تست mtt و تفسیر آن را توضیح می‌دهیم.

تست MTT چیست؟

تست mtt برای تشخیص سمیت سلولی ترکیبات دارویی، مولکول‌های زیستی و ترکیبات شیمیایی انجام می‌شود. در این تست فعالیت متابولیکی سلول‌ها نشانه‌ای از «زنده ماندن سلول» (Viability)، «سمیت سلولی» (Cytotoxicity) ترکیب شیمیایی و «تکثیر» (Proliferation) سلول‌ها است. تست mtt یکی از روش‌های رنگ‌سنجی است. در این روش‌ها رنگ محلول‌ها به دلیل واکنش‌های شیمیایی و وجود یک ماده خاص تغییر می‌کند. در این تست نمک تترارولیوم زرد رنگ به بلوهای نامحلول فورمازان کاهش می‌یابد و رنگ محلول سلول‌ها بنفش می‌شود. در غشای میتوکندری سلول‌های زنده آنزیم‌های ردوکتاز وابسته به NADH و NADPH وجود دارد. این آنزیم‌ها نمک تترازولویم را به فورمازان کاهش می‌دهد. هر چه تعداد سلول‌های زنده بیشتر باشد، شدن رنگ ایجاد شده بیشتر است.

معرف mtt کاتیونی است که از چهار حلقه تشکیل شده است. حلقه مرکزی این نمک از چهار اتم نیتروژن تشکیل شده است که به دو حلقه فنیل و یک حلقه تیازولیل متصل می‌شود. بار مثبت و حلقه‌های لیپوفیل این نمک سبب می‌شود به راحتی از غشای داخلی میتوکندری عبور کند. آنزیم‌های ردوکتاز میتوکندری حلقه مرکزی این ترکیب را تجزیه می‌کند و فورمازان تشکیل می‌شود. از این تست می‌توان برای بررسی اثر غلظت‌های مختلف دارو بر سلول، مقایسه اثر داروها با هم، اثر نوترکیبی‌های ژنتیکی در سلول استفاده کرد.

مراحل تست MTT

آماده کردن محلول‌ها، آماده کردن سلول‌ها، انکوبه کردن سلول‌ها با ترکیب شیمیای و طیف‌سنجی رنگ مراحل اصلی تست mtt است. اولین مرحله انجام این تست آماده کردن محلول mtt است. نمک mtt در آب، اتانول و محلول بافر فسفات حل می‌شود. اما محلول بافر فسفات بهترین گزینه برای آماده کردن محلول mtt است. برای شروع کار تهیه غلظت ۵ mg/ml از این محلول پیشنهاد می‌شود. این محلول زرد رنگ را می‌توان تا ۶ ماه در دمای ۲۰- و برای چند روز در دمای ۴ درجه‌سانتی‌گراد نگه داشت.

سلول‌هایی که در فلاسک کشت داده شده است باید به پلیت‌های ۹۶ چاهکی منتقل شود. سلول‌های چسبنده را می‌توان به‌وسیله آنزیم تریپسین یا روش‌های مکانیکی از فلاسک جدا کرد. به هر چاهک $$10^{3}$$ تا $$10^{5}$$ منتقل می‌شود. نکته مهم این است که تعداد سلول‌ها در تمام چاهک‌ها باید برابر باشد. بهتر است برای هر غلظت ترکیب شیمیایی چند چاهک در نظر گرفته شود. ضلع کوچک‌تر پلیت‌های ۹۶تایی از ۸ چاهک تشکیل شده است. برای منظم‌تر انجام شدن تست معمولا هر ستون به یک غلظت نمونه اختصاص داده می‌شود. یکی از ستون‌های پلیت کنترل مثبت و یکی از ستون‌های آن کنترل منفی است. اگر نمونه دارو باشد، کنترل مثبت شامل سلول‌ها، DMSO، محلول mtt و فاقد دارو است. کنترل منفی شامل دارو، DMSO، محلول MTT و فاقد سلول‌ها است.

پس از انتقال سلول به چاهک‌ها سلول با دارو یا ترکیب شیمیایی مورد نظر ترکیب می‌شود و حداقل ۲۴ ساعت در انکوباتور قرار می‌گیرد. پس از ۲۴ ساعت محیط کشت سلول‌ها با پیپت از چاهک‌ها خارج می‌شود و چاهک با اضافه کردن و بیرون کشیدن بافر فسفات شست و شو داده می‌شود. به هر چاهک ۲۰۰ میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم همراه mtt اضافه می‌کنیم. غلظت نهایی mtt در هر چاهک باید ۵ میکروگرم بر میلی‌لیتر باشد. سپس پلیت به مدت ۴ تا ۶ ساعت در دمای ۳۷ درجه‌سانتی‌گراد در انکوباتور co2 قرار می‌گیرد.

پس از ۴ تا ۶ ساعت محلول چاهک‌ها به‌وسیله میکروپیپت آرام خارج می‌شود. در این مرحله چاهک را شست و شو نمی‌دهیم. شست و شو منجر به از بین رفتن نمک‌های فورمازون رسوب کرده در چاهک می‌شود. سپس ۱۰۰ میکرولیتر محلول DMSO (دی‌متیل سولفوکسید) به هر چاهک اضافه می‌شود. این محلول قطبی فورمازون را در خود حل می‌کند. در ادامه پلیت در فویل آلومینیومی پیچیده و ۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار می‌گیرد. یکبار پس از ۱۵ دقیقه و یکبار پس از ۶۰ دقیقه، جذب mtt در طول موج ۵۵۰ نانومتر اندازه گرفته می‌شود.

تفسیر تست MTT

در بخش‌های قبلی این مطلب از مجله فرادرس اساس و مراحل انجام تست mtt را بررسی کردیم. در این بخش نحوه تفسیر این تست را توضیح می‌دهیم. درصد سلول‌های زنده در هر غلظت ترکیب شیمیایی، پارامتر مهمی در mtt است که به کمک آن می‌توان میزان سمیت سلولی آن ترکیب را مشخص کرد. IC50 (غلظت مهاری | Inhibitory Concentration) و EC50 (غلظت موثر | Effective Concentration) دو پارامتر مهم دیگر در سنجش سمیت سلولی داروها است. EC50 غلظتی از دارو را نشان می‌دهد که ۵۰٪ پاسخ حداکثری را ایجاد می‌کند. IC50 غلظتی از دارو را نشان می‌دهد که منجر به مرگ ۵۰٪ سلول‌ها می‌شود. IC50 برای ترکیبات شیمیایی استفاده می‌شود که یک مسیر بیوشیمیایی در سلول را مهار می‌کنند و درصد زنده‌مانی سلول‌ها را کاهش می‌دهند. EC50 برای ترکیبات شیمیایی استفاده می‌شود که فعالیت یک مسیر بیوشیمیایی و درصد زنده‌مانی سلول‌ها را افزایش می‌دهند. این دو کمیت را می‌توان از نمودار درصد سلول‌های زنده یا سلول‌های مرده برحسب غلظت دارو تعیین کرد.

درصد سلول‌های زنده را می‌توان با معادله زیر محاسبه کرد. در این معادله $$A_{exp}$$ جذب mtt در غلظت‌های متفاوت نمونه، $$A_{neg}$$ میانگین جذب کنترل منفی و $$A_{pos}$$ میانگین جذب کنترل مثبت است.

$$frac{{A_{exp}}-A_{neg}}{A_{pos}}times 100$$

رسم نمودار IC50 و EC50

پس از طیف‌سنجی و محاسبه درصد سلول‌های زنده در هر غلظت می‌توان نمودار درصد سلول‌های زنده به تغییرات غلظت را به‌وسیله نرم‌افزارهای اکسل، پریزم (prism) یا spss رسم و IC50 و EC50 را محاسبه کرد. در این مطلب رسم نمودار با نرم‌افزار اکسل را با هم مرور می‌کنیم. برای رسم نمودار غلظت‌های ماده شیمیایی را در ستون اول و درصد سلول‌های زنده در هر غلظت را در ستون بعدی اضافه می‌کنیم.

از گزینه insert در نوار ابزار بالای صفحه chart و از chart رسم نمودار scatter را انتخاب می‌کنیم. نرم‌افزار نمودار را رسم می‌کند.

با کلیک روی نمودار از پنجره باز شده Add Trendline را انتخاب می‌کنیم. با کلیک بر نمودار رسم شده گزینه‌های set intercept، display equation on chart و display R-square on chart را فعال می‌کنیم.

در معادله خط ایجاد شده y (درصد سلول‌های زنده) را ۵۰ قرار می‌دهیم و مقدار x (غلظت ترکیب شیمیایی) را محاسبه می‌کنیم. به این ترتیب IC50 را بدست می‌آوریم. برای محاسبه EC50 می‌توان از همین روش استفاده کرد. IC50 برای نمودارهای نزولی و EC50 برای نمودارهای صعودی محاسبه می‌شود.

به جای MTT از چه روش‌هایی می‌توان استفاده کرد؟

mtt کاربردی‌ترین تست تشخیص سمیت سلولی است. اما زمانی که انجام این تست امکان‌پذیر نیست می‌توان از روش‌های جایگزین XTT، WST، SRB، MTS، رنگ‌آمیزی مرده-زنده (live-dead assay) و سنجش ATP استفاده کرد.

• تست MTS: معرف این تست نمک ۳-(دی‌متیل تیازول-۲-ایل)-۵-(۳-کاربوکسی‌متوکسی فنیل)-۲-(۴-سولفوفنیل)-۲هیدروژن-تترازولیوم است. از کاهش این نمک به‌وسیله آنزیم‌های ردوکتاز میتوکندری نمک‌های فورمازان محلول در آب تولید می‌شود. مراحل انجام این تست شبیه mtt است. اما مرحله حل کردن نمک‌های فورمازان حذف می‌شود. در نتیجه تست سریع‌تر از mtt انجام می‌شود و نتایج دقیق‌تری دارد.
• تست WST: معرف تست WST مثل mtt و MTS نمک تیازولوم است.معرف این روش از نمک ۲-(متوکسی-۴-نیتروفنیل)-۳-(۴-نیتروفنیل)-۵-(۲،۴-دی‌سولفو فنیل)-۲-هیدروژن-تترازولیوم است که از کاهش آن به‌وسیله آنزیم‌های هیدروژناز سیتوپلاسم فورمازان محلول و نارنجی تولید می‌شود. هزینه این روش از mtt بیشتر است. رنگ نارنجی ایجاد شده شبیه رنگ فنول رد (phenol red) است. به همین دلیل بهتر است از این روش برای محیط‌های فنول رد استفاده نشود.
• SRB: معرف روش SRB رنگ سولفورودامین بی (Sulforhodamine B) است. این رنگ از دو گروه سولفونیک تشکیل شده است که در محیط‌های اسیدی ضعیف به آمینواسیدهای پروتئين سلولی متصل و در محیط‌های بازی جدا می‌شود. رنگ SRB صورتی کم‌رنگ است.
• رنگ‌آمیزی مرده-زنده: در روش رنگ‌آمیزی مرده-زنده از دو رنگ فلورسنت برای رنگ‌آمیزی هسته سلول‌های زنده و مرده استفاده می‌شود. در این روش سلول‌های زنده رنگ آبی و سلول‌های مرده رنگ سبز منتشر می‌کنند. سلول‌ها پس از رنگ‌آمیزی زیر میکروسکوپ فلورسنت بررسی و تعداد سلول‌ها بر اساس شدت نور محاسبه می‌شود.
• سنجش ATP: تست سنجش ATP بر این اساس طراحی شده است که سلول‌های مرده ATP تولید نمی‌کنند و مولکول‌های ATP بلافاصله پس از مرگ سلول به‌وسیله آنزیم ATPas تجزیه می‌شود. در این تست از آنزیم لوسیفراز کرم شب‌تاب و لوسیفرین استفاده می‌شود. لوسیفراز با مصرف ATP لوسیفرین را به اوکسیلوسفرین تبدیل می‌کند. این واکنش با فوتون‌های نوری در طول موج ۵۵۰ تا ۵۷۰ نانومتر (سبز تا زرد) همراه است. برای سنجش ATP سلول‌های زنده لیز و ATPase مهار می‌شود. هر چه غلظت ATP در محیط کشت بیشتر باشد، شدت نور ایجاد شده و درصد سلول‌های زنده بیشتر است.

سوالات متداول

در این بخش از مطلب مجله فرادرس به تعدادی از سوالات متداول پیرامون تست mtt پاسخ می‌دهیم.

تست MTT مخفف چیست؟

در تست MTT از واکنش کاهش نمک ۳-(۴،۵-دی‌متیل تیازول-۲-یل)-۲،۵دی‌فنیل تترازولیوم برومید برای تشخیص فعالیت سلول استفاده می‌شود. MTT مخفف نام این نمک است. حرف m نشانه متیل، اولین حرف t نشانه تیازولیل و دومین حرف t نشانه تترازولیوم است.

در چه مواردی نمی‌توان از تست MTT استفاده کرد؟

تست MTT روشی کم‌هزینه، سریع و راحت برای بررسی سمیت سلولی ترکیبات شیمیایی و زیستی است. اما استفاده از آن محدودیت‌هایی دارد. از این تست نمی‌توان برای ترکیباتی که متابولیسم سلول‌ها را تغییر می‌دهند استفاده کرد. نمک MTT در بعضی از سلول‌ها سمیت ایجاد می‌کند و سمیت سلولی ماده مورد آزمایش را افزایش می‌دهد. از سلول‌هایی تست MTT برای آن‌ها انجام شده است نمی‌توان در ادامه آزمایش استفاده کرد. به همین دلیل در مواردی که تعداد سلول‌های محیط کشت کم است این روش پیشنهاد نمی‌شود.