cDNA یا DNA مکمل حاصل رونویسی معکوس است، یعنی از روی یک رشته RNA به وسیله آنزیمی خاص، رشته DNA ساخته شده است. این نوع DNA فاقد نواحی غیرکدکننده است و برای ایجاد کتابخانه‌های cDNA و کلون کردن ژن‌ها می‌توان از آن استفاده کرد. در این مطلب از مجله فرادرس یاد می‌گیریم که cDNA چیست و پروتکل سنتز آن شامل چه مراحلی است، بنابراین با مطالعه این مطلب تا انتها اطلاعات مفیدی در مورد این نوع DNA به دست خواهید آورد.

cDNA چیست؟

«DNA مکمل» (Complementary DNA | cDNA) نوعی مولکول DNA است که از روی یک رشته RNA به وسیله آنزیم «رونویسی معکوس» (Reverse Transcriptase) ساخته می‌شود و به این فرآیند ساخته شدن cDNA نیز «رونویسی معکوس» (Reverse Transcription) می‌گوییم.

برای تسلط و یادگیری مفاهیم کلیدی و بنیاد ژنتیک مولکولی پیشنهاد می‌دهیم از فیلم آموزش ژنتیک مولکولی – جامع و با مفاهیم کلیدی فرادرس استفاده کنید که لینک آن را در کادر زیر درج کرده‌ایم.

به طور معمول ما انتظار داریم که از روی مولکول‌های DNA، رشته‌ RNA در طی رونویسی ساخته شود یا از توالی DNA برای همانندسازی و تولید رشته DNA جدید استفاده شود، اما در تولید این cDNA این فرآیند به صورت معکوس پیش می‌رود و این موضوع باعث به وجود آمدن یک تفاوت بسیار مهم بین رشته DNA و cDNA شده است. در رشته DNA نواحی کدکننده و غیرکدکننده وجود دارند، در حالی که cDNA فقط از توالی‌های کدکننده ساخته شده است، همین موضوع باعث شده است که توالی‌های cDNA از DNA متناظر با آن کوتاه‌تر باشند.

در صورتی که تمایل به شناخت ساختار DNA و کسب اطلاعات کامل در مورد این مولکول زیستی دارید، مطالعه مطلب «ساختار DNA – به زبان ساده» از مجله فرادرس را پیشنهاد می‌دهیم.

چرا به سنتز cDNA از روی mRNA نیاز داریم؟

برای مطالعه توالی کدکننده یک ژن باید به mRNA دسترسی داشته باشیم، زیرا در mRNA نواحی غیرکدکننده حذف شده‌اند و تنها ناحیه‌ای که کدکننده پروتئین است وجود دارد، اما مطالعه mRNA  با توجه به ماهیت ناپایدار آن دشوار است و ساخت cDNA که مانند DNA ژنومی از دو رشته تشکیل شده است، به ما کمک می‌کند تا به مولکولی با ماهیتی پایدار دسترسی داشته باشیم و نگران تجزیه mRNA توسط آنزیم‌های تجزیه‌کننده RNA نباشیم.

یادگیری ژنتیک با فرادرس

ژنتیک یکی از زیر شاخه‌های زیست‌شناسی است که از منظرهای متفاوت می‌توان آن را بررسی کرد، برای مثال مطالعات ژنتیک جمعیت با مطالعات ژنتیک مولکولی و ژنتیک سرطان متفاوت هستند. نکاتی که در هر زمینه باید به آن‌ها مسلط باشیم نیز با توجه به زمینه مورد بحث متفاوت است اما برای ورود به دنیای ژنتیک باید با مفاهیم اولیه‌ای که توسط زیست‌شناسی سلولی و مولکولی تعریف شده‌اند، آشنا شد و سپس با توجه به نیاز خود، مسیر یادگیری را آغاز کرد.

فرادرس با توجه به گستردگی دنیای ژنتیک، فیلم‌های آموزشی متنوعی را تولید و منتشر کرده است که با استفاده از آن‌ها می‌توان مسیر یادگیری را سریع‌تر پیمود. در ادامه تعدادی لینک دسترسی به تعدادی از آن‌ها را در اختیار شما قرار می‌دهیم.

کاربرد cDNA چیست؟

حالا که یاد گرفتیم cDNA چیست، زمان آن رسیده است که به کاربردهای آن بپردازیم. DNA مکمل به طور معمول در ایجاد کلون از ژن‌ها به کار گرفته می‌شود یا به عنوان نشانگر ژنی استفاده می‌شود. برای تولید کتابخانه‌های cDNA نیز از این مولکول استفاده می‌شود.

گاهی در مطالعات تحقیقاتی، هدف پژوهشگران تولید پروتئين از روی اطلاعات ژنتیکی خاصی است، به همین دلیل آن‌ها باید اطلاعات ژنتیکی را از سلولی به سلول دیگری منتقل کنند، در این شرایط از cDNA استفاده می‌شود، زیرا این مولکول فاقد نواحی غیرکدکننده است و با بیان آن می‌توان بدون نگرانی برای روند بلوغ mRNA و جداسازی نواحی غیرکدکننده به پروتئین حاصل از بیان ژن دسترسی پیدا کرد.

«واکنش زنجیره‌ای پلیمراز» (Polymerase Chain Reaction | PCR) روشی برای افزایش تعداد نسخه‌هایی است که از یک توالی DNA داریم. یکی از واکنش‌هایی که در مراحل ابتدایی PCR انجام می‌شود،‌ رونویسی معکوس با هدف تولید cDNA است و پس از تشکیل cDNA سلسله واکنش‌های PCR آغاز می‌شوند.

از cDNA برای مطالعه بیان ژن‌ها از طریق روش‌های زیر نیز استفاده می شود.

• توالی‌یابی RNA
• «واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ» (Real-Time Polymerase Chain Reaction |RT-PCR)

پروتکل سنتز cDNA

تا اینجا یاد گرفتیم که cDNA چیست و از RNA برای تولید رشته‌های cDNA به عنوان رشته الگو استفاده می‌شود. در دنیای سلولی به طور طبیعی سنتز شدن cDNA را در ویروس‌ها و رتروترانسوپوزون‌ها می‌بینیم، زیرا اطلاعات ژنتیکی آن‌ها به صورت RNA وجود دارد و به منظور ادغام آن در DNA ژنومی سلول هدف، باید ابتدا RNA را به cDNA تبدیل کنند. برای مطالعات زیست‌شناسی مولکولی، RNA از DNA ژنومی، پروتئین‌ها و دیگر اجزای سلول هدف جدا و خالص می‌شود، سپس به کمک آنزیم رونویسی معکوس از روی آن cDNA ساخته می‌شود. برای خالص‌سازی RNA می‌توان از روش‌های مختلفی استفاده کرد که دو مورد از آن‌ها را در ادامه نام می‌بریم.

• روش «فنل-کلروفرم» (Phenol-Chloroform)
• روش «سیلیکاژل» (Silica Column)

انتخاب روش استخراج RNA به منبع سلولی بستگی دارد، به عنوان مثال در صورتی که قصد جداسازی RNA از سلول گیاهی را داشته باشیم به ترکیباتی مانند پلی‌وینیل‌پیرولیدون برای حذف ترکیباتی که RNA را غیرقابل استفاده می‌کند، نیاز داریم. از جمله‌ این ترکیبات می‌توان به ترکیبات فنولی و کربوهیدرات‌ها اشاره کرد.

DNA و پروتئین‌ها نیز باید از محلولی که حاوی RNA است، حذف شوند، بنابراین از آنزیم‌هایی مانند DNase و پروتئیناز K استفاده می‌کنیم. مسئله دیگری که در حین استخراج RNA باید به آن توجه نشان داد، حفظ ساختار مولکول RNA است، به این منظور باید آنزیم‌های تجزیه کننده RNA  حذف شوند که برای این کار از ترکیباتی که در ادامه نام می‌بریم استفاده می‌شود.

• ایزوتیوسیانات گوانیدینیوم
• «سدیم دودسیل سولفات» (SDS)
• فنل
• کلروفرم

پس از آن که RNA از ترکیبات دیگر سلول به طور کامل جدا شد، از الکل استفاده می‌کنیم تا RNA رسوب کند و سپس به سراغ فرآیند رونویسی معکوس می‌رویم که دارای دو مرحله زیر است.

• سنتز رشته اول
• سنتز رشته دوم

سنتز رشته اول

برای سنتز رشته اول در فرآیند تولید cDNA به یک آنزیم رونویسی معکوس و RNA خالص شده نیاز داریم. برای آن که بتوانیم بیان یک ژن را طی فرآیندهای RT-PCR یا توالی‌یابی PCR تحلیل کنیم، از mRNA برای تولید cDNA استفاده می‌شود. برای شروع فرآیند رونویسی معکوس به نوعی پرایمر نیاز داریم که با عنوان «پرایمر oligo-dT» شناخته می‌شوند. این پرایمرها مکمل معکوس دم پلی‌ A موجود در انتهای ‘۳ تمام mRNAها است. با اتصال پرایمر oligo-dT به دم پلی‌ A، جایگاه اتصال آنزیم رونویسی معکوس ایجاد می‌شود و به این ترتیب آنزیم می‌تواند ساخت cDNA را آغاز کند.

سنتز رشته دوم

پس از آن که رشته اول ساخته شد، هیبرید RNA-DNA می‌تواند دو سرنوشت متفاوت داشته باشد.

• رشته دوم سنتز شود.
• به همان شکل در آزمایش‌های پایین‌دست مورد استفاده قرار بگیرد.

یک روش ابتدایی که برای سنتز رشته دوم وجود دارد بر اساس ساختار سنجاق‌سری استوار است. در این روش در انتهای ‘۳ رشته اول cDNA با هدف تحریک سنتز رشته دوم ساختار سنجاق‌سری ایجاد می‌شود؛ اما این فرآیند اتفاقی تصادفی است. ممکن است هیدرولیز حلقه ایجاد شده منجر به از دست رفتن بخشی از اطلاعات شود. در روش بهینه‌شده‌ای که دانشمندان ساخته‌اند، از آنزیم RNase H برای جداسازی mRNA از رشته اول cDNA استفاده می‌شود. در گام بعد DNA پلیمراز یک به رشته متصل شده و رشته دوم را می‌سازد.

جمع‌بندی

در این مطلب از مجله فرادرس یاد گرفتیم که cDNA چیست و چطور توسط آنزیم رونویسی معکوس از روی رشته RNA ساخته می‌شود. به طور کلی ویروس‌ها برای آن که بتوانند اطلاعات ژنتیکی خود را که به طور معمول به شکل RNA موجود است در DNA سلول میزبان ادغام کنند، از آنزیم رونویسی معکوس استفاده می‌کنند و cDNA را می‌سازند، اما پژوهشگران از این آنزیم برای دستیابی به اهداف دیگری از قبیل ساخت کتابخانه cDNA یا به پیش بردن روند PCR استفاده می‌کنند.